Histoire

n. m. Instrument permettant l'observation, en donnant une image très agrandie, d'objets dont les dimensions sont trop petites pour que l'œil puisse les distinguer directement.

Alors que l'utilisation de la loupe, due à Antonie Van Leeuwenhoek (1632-1723), remonte au XVIIe siècle, l'apparition des premiers microscopes à association de lentilles est plus récente ; malgré la qualité très médiocre de ces premiers instruments, ils permirent néanmoins des découvertes fondamentales. Par la suite, les travaux de Giovanni Amici (1786-1863) et de Ernst Abbe (1840-1905) aboutirent à la construction d'objectifs nettement plus performants. En dehors des techniques optiques et dérivées (microscopie électronique) qui ont continué de se développer, d'autres types de microscopes, fondés sur des principes totalement nouveaux, ont permis depuis quelques années d'atteindre l'échelle atomique : ce sont les différents microscopes de contact et de proximité.

La microscopie optique

La loupe

Le dispositif grossissant le plus simple est la loupe, lentille sphérique convergente (à bords minces). On place l'objet examiné au foyer de la loupe, le grossissement obtenu est inversement proportionnel à la distance focale de la lentille. Pour avoir de forts grossissements, il est nécessaire d'employer une loupe de très faible focale. Mais les lois de l'optique imposent à ces loupes d'être très bombées et de taille réduite ; une bonne observation requiert alors un éclairage puissant et, surtout, des distances loupe-objet et loupe-œil très courtes ; leur utilisation s'avère donc malaisée.

Le microscope composé

Il est constitué d'une association de lentilles. Un tel instrument comprend deux éléments essentiels : un objectif et un oculaire maintenus à une distance invariable l'un par rapport à l'autre. L'objectif sert à former une image agrandie, réelle et inversée de l'objet. Cette image intermédiaire est ensuite observée au moyen d'un oculaire, qui joue le rôle de loupe ; l'œil, situéà la pupille de sortie de l'oculaire, perçoit donc une image de l'objet grossie, virtuelle, et inversée comme l'image intermédiaire donnée par l'objectif.

Une donnée essentielle d'un microscope est sa puissance ; c'est le quotient du " diamètre (angulaire) apparent de l'image finale " par la " longueur de l'objet ". Une autre donnée importante est son grossissement ; c'est le rapport du " diamètre (angulaire) apparent de l'image finale " au " diamètre (angulaire) apparent de l'objet observé, à l'œil nu, au punctum proximum ".

Un microscope classique d'observation en transmission comporte, outre l'oculaire et l'objectif - souvent complexe puisqu'il peut contenir jusqu'à dix lentilles -, un système d'illumination, un condenseur et un porte-échantillon.

Dans le microscope polarisant, des filtres polarisants sont intercalés sur le trajet de la lumière, avant et après la traversée de l'échantillon ; grâce au phénomène de polarisation chromatique, les structures de préparations cristallines observées apparaissent diversement colorées, suivant leur biréfringence.

L'étude de la formation des images a permis à Frederik Zernike de réaliser, en 1953, par divers perfectionnements, le microscope à contraste de phase, qui permet de mettre en évidence des détails d'objets incolores et transparents, qui seraient invisibles avec les microscopes classiques.

Enfin, le microscope métallographique d'observation en réflexion est conçu pour l'étude de la surface d'échantillons opaques, tels les métaux ; dans un tel appareil, l'échantillon est éclairé non par transparence, mais du côté où on l'observe, par un système de miroirs, au travers de l'objectif lui-même.

Les microscopes modernes comprennent généralement deux oculaires, pour permettre l'observation avec les deux yeux (microscopes binoculaires).

L'utilisation de faisceaux laser très fins a permis la réalisation du microscope confocal à balayage dans lequel le faisceau d'un laser est focalisé sur un point de l'objet àétudier, qui est aussi le point sur lequel est focalisé l'objectif. Un dispositif d'entraînement du faisceau laser permet d'effectuer un balayage de l'objet dans un plan et le déplacement de l'objectif permet de varier la profondeur de ce plan. Cette technique est surtout utilisée pour étudier la localisation de molécules fluorescentes fixées de façon spécifique dans la cellule.

Les meilleurs microscopes classiques ne peuvent dépasser un grossissement pratique de 1000. Cette limite est imposée par la diffraction de la lumière, qui empêche de discerner deux points très rapprochés et qui s'exprime par la relation d'Abbe. Celle-ci définit la distance minimale, d, séparant deux points encore discernables quand une lumière monochromatique de longueur d'onde ? est utilisée : oùd est le pouvoir séparateur de diffraction de l'objectif qui sert à former l'image de l'objet, n l'indice de réfraction du milieu séparant l'objet de la première lentille de l'objectif, et a le demi-angle du cône de lumière qui pénètre dans l'objectif ; la grandeur " n sin a " est souvent appelée ouverture numérique de l'objectif.

Pour obtenir un pouvoir séparateur de diffraction meilleur que celui obtenu en lumière visible, divers procédés ont été mis au point. Le premier consiste à faire les observations à l'aide de lumières de longueurs d'onde courtes (bleu et proche ultraviolet) ; mais l'observation s'avère délicate, car l'œil est très peu sensible à ces radiations. Une autre solution consiste à augmenter l'indice de réfraction du milieu (habituellement l'air) séparant la préparation de l'objectif ; on réalise pour cela des objectifs à immersion, qui permettent de remplacer l'air - d'indice de réfraction égal à 1 - par une huile transparente (monobromonaphtalène) d'indice supérieur (n = 1,65). Malheureusement, ces divers procédés n'améliorent le grossissement et la résolution que dans une mesure très limitée. L'emploi de l'optique électronique à la place de l'optique lumineuse a seul permis de repousser cette limite.

La microscopie électronique

Si un électron est accéléré sous une différence de potentielélectrique V, on montre que l'onde quantique qui lui est associée a pour longueur d'onde , où? est exprimée en angströms, et V en volts ; pour V = 100 kV, on obtient ? = 0,0387 Å, longueur d'onde beaucoup plus faible que celle d'une radiation lumineuse.

Ainsi, pour réduire le pouvoir séparateur, le microscope électronique utilise non plus des ondes lumineuses, mais des faisceaux d'électrons ; l'expérience révèle cependant qu'il est difficile de réduire celui-ci d'un facteur supérieur à 200 par rapport aux résultats de l'optique lumineuse, et cela en raison des défauts des lentilles électromagnétiques utilisées ; des objets séparés par des distances de quelques angströms peuvent néanmoins être distingués, avec les appareils récents.

Le principe de la microscopie électronique en transmission présente des analogies sensibles avec la microscopie optique. Dans un microscope électronique, nous retrouvons une source, composée, dans ce cas, d'un filament à haute température, qui émet un faisceau d'électrons ; ce filament, en général de tungstène, est portéà un potentiel élevé (- 100 kV, par exemple). Le faisceau électronique est ensuite légèrement focalisé, et accéléré par une électrode (anode) reliée à la masse. Puis, ce faisceau est dirigé, grâce à un système de lentilles électromagnétiques, ou condenseurs, vers l'échantillon à examiner ; ces lentilles, qui jouent le même rôle que les lentilles classiques en verre du microscope optique, sont ici un assemblage complexe de bobines électromagnétiques qui produisent un champ magnétique lorsqu'elles sont traversées par un courant électrique, de telle manière qu'il agisse sur le faisceau d'électrons pour le faire converger ou diverger. L'échantillon est placé sur une platine possédant un nombre de degrés de liberté suffisant pour pouvoir orienter la préparation dans différentes directions par rapport au flux d'électrons. Une lentille magnétique, appelée objectif, donne une image de l'objet agrandie de 10 à 100 fois. Cette image est de nouveau reprise par une lentille intermédiaire. Enfin, une lentille magnétique, dite de projection, donne une image agrandie de l'image intermédiaire, que l'on observe sur un écran fluorescent. Cet écran peut éventuellement être escamoté, pour permettre aux électrons d'impressionner une plaque photographique. Pour favoriser le déplacement des électrons à l'intérieur du microscope, des pompes àvide maintiennent dans l'appareil un vide assez poussé (environ 10-5 mm de mercure).

Le microscope électronique à transmission présente cependant un inconvénient : les échantillons doivent être de petite taille (environ 10 mm2) et extrêmement minces, pour permettre le passage des électrons ; les microscopes électroniques courants autorisent l'observation d'échantillons dont l'épaisseur ne dépasse pas 0,1 à 0,2 micron (selon la densité de la substance).

Un autre type de microscope électronique a été conçu, fondé sur un principe tout à fait différent : c'est le microscope à balayage ; alors que le microscope à transmission donne une image globale de l'échantillon, le microscope à balayage donne une image point par point. La surface de l'échantillon est explorée par un faisceau d'électrons très fin ; les électrons diffusés ou émis par la surface explorée sont focalisés pour former une image qu'on peut soit observer directement et photographier, soit numériser et stocker. Bien que la résolution d'un microscope électronique à balayage soit, en général, inférieure à celle d'un microscope électronique à transmission, cet appareil est un outil incomparable pour l'observation de la surface d'objets ; la grande profondeur de champ de ce microscope permet d'obtenir des images ayant un relief apparent impressionnant.

Les microscopies de champ proche

Dans ces techniques, qui sont exclusivement destinées à observer la surface des objets, le principe général consiste à approcher une pointe détectrice très près d'une surface et à construire une image du relief de celle-ci point par point à partir de la mesure de distance donnée par le détecteur. L'existence de systèmes piézo-électriques permettant de contrôler des déplacements à l'angström près a donnéà ces microscopes un pouvoir séparateur à l'échelle atomique. Les différents types de microscopes sont caractérisés par le phénomène physique choisi pour mesurer la distance entre pointe et surface.

Le microscope à effet tunnel

Lorsque deux conducteurs portés à des potentiels électriques différents sont séparés par une barrière isolante de dimension atomique, un courant électrique peut circuler entre eux à travers l'isolant, par suite d'un effet purement quantique appelé effet tunnel. L'intensité de ce courant tunnel dépend très fortement de la distance. Dans le microscope, l'un des conducteurs est l'objet étudié, l'autre une pointe métallique extrêmement fine qu'on approche par des méthodes piézo-électriques à quelques angströms de l'objet, jusqu'à ce qu'un courant tunnel d'une intensité programmée soit atteint. On sait alors que la pointe est à une distance connue de la surface. Il suffit de mesurer la position de la pointe en face de chaque point de la surface pour avoir une topographie de celle-ci, qu'on traduit en image par des méthodes informatiques. Cette méthode, limitée aux surfaces conductrices, a permis d'identifier la position des atomes un à un.

Le microscope à force atomique

La grandeur utilisée pour apprécier la distance pointe-surface est ici la force de répulsion (force de contact) d'origine électrostatique qui se produit immanquablement lorsque deux objets sont très proches, même s'ils ne portent aucune charge libre. Cette force se traduit par la flexion d'un levier dont l'orientation est mesurée optiquement par un étroit faisceau laser qui se réfléchit sur un miroir porté par le levier. Le rapprochement de la surface entraîne une variation de la force, donc de la déflexion du faisceau. Un asservissement permet donc de demeurer à distance constante de la surface lors du balayage. La variation de la force en fonction de la distance est beaucoup moins rapide dans ce montage que dans le montage à effet tunnel, ce qui entraîne un moins bon pouvoir séparateur. L'avantage, en revanche, est de pouvoir explorer n'importe quelle surface, conductrice ou isolante. Des variantes de cette technique utilisent d'autres forces, comme par exemple les forces magnétiques.

D'une façon générale, ces microscopies de proximité, si elles permettent de s'affranchir des limites liées aux longueurs d'onde des radiations utilisées en microscopie optique et électronique, donnent des images dont l'interprétation est souvent délicate, faute de savoir exactement ce qui est observé.