Etude structurale et fonctionnelle d’une protéine membranaire au cuivre, PcoB, chez la bactérie Caulobacter crescentus.

Le cuivre est un oligoélément essentiel. Cependant, ses propriétés chimiques en font également un métal potentiellement toxique. Il est donc primordial pour l'organisme que le taux et la distribution de cuivre soient finement régulés afin d'éviter un excès de cuivre susceptible d'entraîner une production de radicaux libres et leurs dégâts oxydatifs. Les protéines à cuivre sont retrouvées dans tous les compartiments cellulaires et extracellulaires des organismes et jouent un rôle notamment dans le transport du cuivre. Comprendre leur structure et leur mode d’action est donc essentiel pour appréhender le métabolisme et la régulation de l'homéostasie du cuivre.

Dans le cadre de ce mémoire, nous nous intéresserons plus particulièrement à la protéine PcoB de la bactérie Caulobacter crescentus utilisée comme modèle de travail pour étudier les processus cellulaires. Les recherches de l’équipe du Prof. Matroule (Département de Biologie, Unamur) suggèrent que la protéine serait une pompe à efflux de la membrane externe de la bactérie, contribuant à la détoxification du cuivre.¹

Dans un premier temps, la protéine, préalablement surproduite en bactéries, sera purifiée par chromatographie et renaturée par une méthode développée au sein du CPB. Afin de mimer l’environnement naturel de PcoB, elle sera ensuite transférée au sein de liposomes, vésicules lipidiques, formant ainsi des protéoliposomes.

Dans un deuxième temps, la liaison protéine-cuivre sera évaluée in vitro par diverses techniques spectroscopiques (UV, fluorescence, dichroïsme circulaire) et calorimétriques (ITC). Nous mettrons ainsi en évidence la spécificité (ou non) de la protéine pour le cuivre, la stœchiométrie de la liaison et la constante de dissociation du complexe cuivre-protéine.

En parallèle des études in vitro, nous utiliserons le clonage et la microscopie à fluorescence pour localiser précisément la protéine in vivo au niveau de la membrane bactérienne.

Enfin, un test d’activité de transport sera développé pour mettre en évidence le passage d’ions métalliques (cuivre, nickel,…) au travers de PcoB.

Mémoire en collaboration avec l’URBM, département de Biologie

1) Lawarée E, Gillet S, Louis G, Tilquin F, Le Blastier S, Cambier P, Matroule JY. Nat Microbiol. 2016, 1(9):16098.